طراحی پرایمر برای تکنیک Multiplex PCR

زمان تخمینی مطالعه: 10 دقیقه

نمای کلی و اصول Multiplex PCR

تکنیک Multiplex PCR یا پی سی آر چندتایی اولین بار در سال 1988 به‌عنوان روشی برای پی‌بردن به وجود حذف‌های بیماری‌زا در توالی ژن دیستروفین – بزرگ‌ترین ژن شناخته شده انسانی – توصیف شد.

به‌مرور محققین در سایر زمینه‌های تشخیصی اسید نوکلئیک مانند آنالیز جهش و پلی‌مورفیسم، تجزیه و تحلیل کمّی، و شناسایی RNA از این روش استفاده کردند.

در زمینه بیماری‌های عفونی، این تکنیک ابزاری ارزشمند برای تشخیص و افتراق همزمان چند پاتوژن به‌حساب می‌آید. با استفاده از تکنیک Multiplex PCR می‌توان به‌طرز قابل توجهی در زمان و هزینه آزمایشگاه صرفه‌جویی کرد.

اصول Multiplex PCR بر پایه تکثیر همزمان چند توالی هدف یا الگو در یک لوله واکنش، با به‌کارگیری چند جفت پرایمر می‌باشد. این تکثیرِ همزمان، به سازگاری پرایمرهای PCR مورد استفاده در واکنش بستگی دارد.

همه جفت پرایمرها باید دمای ذوب (Tm) مشابهی داشته‌باشند تا در دماهای تقریباً یکسانی به توالی DNA مکمل متصل شده و از آن جدا شوند.

مرحله‌ی تشخیصی بعد از انجام Multiplex PCR، می‌تواند به‌راحتی توسط الکتروفورز ژل و با افتراق محصولات PCR با توجه به اختلاف طول توالی‌های هدف انجام شود؛ هرچند روش‌های کمّی و اختصاصی‌تری مثل پروب‌های هیبریدیزاسیون هم برای شناسایی محصولات وجود دارند.

بازده Multiplex PCR

به‌منظور بهبود عملکرد PCR چندتایی، باید مواردی مانند طراحی هوشمندانه پرایمرها، بهینه‌سازی اجزای مخلوط واکنش و غلظت آن‌ها، و پدیده تکثیر ترجیحی را مدنظر قرار دهید.

پیشنهاد: دوره جامع طراحی پرایمر یک فرصت طلایی برای یادگیری حرفه‌ای طراحی پرایمر در تکنیک Multiplex PCR با استفاده از ابزار‌های پرکاربرد در این حوزه است.

ثبت‌نام در دوره جامع طراحی پرایمر

طراحی پرایمرها

پارامترهای طراحی پرایمر برای Multiplex PCR همانند PCR‌های Uniplex (تک‌محصول) است، با این تفاوت که بایستی به‌جای یک جفت، چند جفت پرایمر (بسته به تعداد نواحی موردمطالعه) طراحی کنید.

در حالت ایده‌آل، همه جفت پرایمرهای طراحی‌شده باید بازده تکثیر مشابهی برای ناحیه هدف خود داشته‌باشند. به این منظور، از جفت پرایمرهایی استفاده می‌شود که دارای دمای بهینه اتصال (annealing) تقریباً مشابه بوده و از نظر توالی با هم همولوژی ندارند.

در Multiplex PCR وجود بیش از یک جفت پرایمر، شانس تولید محصولات کاذب را به‌دلیل تشکیل پرایمر دایمرها افزایش می‌دهد.

ممکن است این محصولات غیراختصاصی با کارایی بیشتری نسبت به هدف موردنظر تکثیر شوند، اجزای واکنش (مثل دئوکسی ریبونوکلئوزید تری فسفات‌ها یا dNTPs) را مصرف کنند و در مراحل اتصال پرایمر به DNA الگو (annealing) و پلیمریزاسیون (extension) ایجاد اختلال نمایند. بنابراین، در PCR‌های چندتایی باید چنین برهمکنش‌های غیر اختصاصی را به حداقل برسانید.

یک راه نسبتا ساده برای غلبه بر این مشکل، استفاده از PCR شروع داغ (hot start) است. این تکنیک اغلبِ واکنش‌های غیر اختصاصی به‌ویژه تولید پرایمر دایمرها را در دمای پایین (4 تا 25 درجه سانتیگراد) حذف می‌کند؛ چراکه DNA پلیمرازِ این نوع PCR تنها در دماهای بالا (مثلا 94 درجه سانتیگراد) فعال می‌شود.

به‌طور کلی باید بگوییم که ابزار دقیقی برای پیش‌بینی سازگاری کامل جفت پرایمرها با هم در تیوب آزمایش وجود ندارد. پس برای بررسی بازده Multiplex PCR، حتما بایستی آزمایش تجربی انجام دهید و نتایج آن را به‌منظور به‌کار‌بردن استراتژی جدید یا تغییر شرایط آزمایش تحلیل کنید.

اجزای واکنش

تغییر غلظت اجزای واکنش مانند بافر، dNTP‌ها و آنزیم پلیمراز در PCR چندتایی نسبت به آنچه برای اکثر PCR های تک‌محصول گزارش شده‌، معمولاً منجر به بهبود اندکی در حساسیت یا اختصاصیت تست می‌شود.

به‌عنوان مثال، تحقیقی بیان می‌کند که در Multiplex PCR برای ژن دیستروفین (طراحی شده برای ۹ توالی الگو)، برای رسیدن به تکثیر بهینه همه نواحی، ضروری است که غلظت آنزیم DNA پلیمراز چهار تا پنج برابر بیشتر از مقدار مورد نیاز در PCR تک‌محصول باشد.

توجه کنید که افزایش غلظت آنزیم و سایر ترکیبات واکنش ممکن است احتمال اتصال پرایمر به الگوی اشتباه و تولید محصولات غیر اختصاصی را نیز افزایش دهد؛ پس بهینه سازی این اجزا در PCR بسیار مهم است.

مطالعاتی گزارش داده‌اند که استفاده از ترکیباتی مانند دی متیل سولفوکساید، گلیسرول، آلبومین سرم گاوی، یا بتایین، در Multiplex PCR سودمند است. این مواد به جلوگیری از توقف پلیمریزاسیون، که می‌تواند به‌خاطر تشکیل ساختارهای ثانویه در مناطقی از DNA الگو رخ دهد، کمک می‌کنند. همچنین ممکن است به‌عنوان عوامل بی‌ثبات کننده، دمای ذوب توالی‌های غنی از GC را کاهش دهند، یا به‌عنوان محافظ اسمزی عمل کرده و مقاومت پلیمراز را در برابر تخریب افزایش دهند.

پیشنهاد: به‌منظور ثبت سفارش طراحی پرایمر برای مالتیپلکس PCR به صفحه تهیه پلن‌های طراحی پرایمر و پروب مراجعه فرمایید.  طراحی پرایمر‌ در میزکار وانیار و زیرنظر کارشناسان بیوانفورماتیک صورت می‌گیرد.

تکثیر ترجیحی

تکثیر ترجیحی، اشاره بر یک پدیده شناخته‌شده در تست‌های Multiplex PCR دارد که در آن تکثیر یک توالی هدف بر دیگری اولویت داده‌می‌شود. بر اساس مدل‌سازی نظری و مطالعات تجربی، دو دسته اصلی از فرایندهایی که این سوگیری را القا می‌کنند، شناسایی شده‌اند:

رانش پی سی آر (PCR drift)

رانش PCR به‌دلیل رخدادهای تصادفی در چرخه‌های اولیه واکنش اتفاق می‌افتد و موجب تکثیر نابرابر نواحی هدف می‌شود. این بایاس می‌تواند به‌خاطر غلظت‌های بسیار پایین DNA الگو، تغییر در پروفایل‌های حرارتی ترموسایکلر، یا یک خطای آزمایشگاهی ساده ایجاد شود. رانش PCR می‌تواند بر حساسیت و دقت Multiplex PCR اثر بگذارد.

انتخاب پی سی آر (PCR selection)

از طرف دیگر، انتخاب PCR مکانیزمی است که به‌دلیل ویژگی‌های توالی الگو، توالی‌های طرفین (flanking) آن، یا کل ژنوم هدف، تکثیر توالی خاصی بر دیگری ترجیح داده‌می‌شود. از جمله این ویژگی‌ها عبارتند از:

• تفاوت توالی الگوها از نظر محتوای GC: هرچه محتوای GC الگو بیشتر باشد، جداسازی دو رشته (denaturation) طی PCR سخت‌تر می‌شود.
• تفاوت توالی پرایمرها از نظر محتوای GC: هرچه محتوای GC پرایمر بالاتر باشد، محکم‌تر به توالی الگو می‌چسبد.
• دسترسی متفاوت پرایمرها به توالی‌های درون ژنوم به‌خاطر وجود ساختارهای ثانویه
• تعداد کپی‌های ژنی در ژنوم

انتخاب PCR می‌تواند بر اختصاصیت و دقت Multiplex PCR اثر بگذارد.

*** دقت کنید که طراحی دقیق پرایمرها برای جلوگیری از بایاسِ انتخاب PCR بسیار مهم است.

پیشنهاد: از مقاله آموزشی Nested PCR و طراحی پرایمر برای آن، بازدید نمایید.

انواع Multiplex PCR

انواع مختلفی از Multiplex PCR وجود دارد که درواقع ترکیبی از این تکنیک با سایر تکنیک‌ها هستند و برای افزایش قابلیت‌های آن ابداع شده‌اند. از جمله این موارد عبارتند از:

• Nested Multiplex PCR (ترکیب تکنیک Nested-PCR با PCR چندتایی)
• Reverse Transcription Multiplex PCR (ترکیب تکنیک RT-PCR با PCR چندتایی)
• Real-time Multiplex PCR (ترکیب تکنیک Real-time PCR (qPCR) با PCR چندتایی)

در Real-time Multiplex PCR، با کاربرد پروب‌های هیبریدیزاسیون که با فلوروفورها (ترکیبات فلورسنت) برچسب‌گذاری شده‌اند، تشخیص محصولات PCR با بررسی سیگنال‌های فلورسانس ساطع شده صورت‌می‌گیرد. این تکنیک در مقایسه با Multiplex PCR معمولی، می‌تواند به‌طور کیفی و کمی چندین هدف مختلف با سایز مشابه را تشخیص دهد.

• Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

نوعی PCR چندتایی که برای شناسایی تغییرات تعداد کپی در سطح اگزون استفاده می‌شود.

پیشنهاد: افزایش فرصت‌های شغلی و تحقیقاتی با شرکت در دوره بیوانفورماتیک عمومی و کسب مهارت‌های اساسی بیوانفورماتیک.

ثبت‌نام در دوره بیوانفورماتیک عمومی

کاربردها

Multiplex PCR در زمینه‌های مختلفی مانند بیماری‌های عفونی و ژنتیکی، پزشکی قانونی، علوم کشاورزی و امنیت غذایی، و محیط زیست کاربرد دارد. در این بخش به ۳ مورد زیر اشاره می‌کنیم:

Multiplex PCR در ویروس‌شناسی

در طول سال‌های گذشته، بسیاری از مطالعات بالینی و اپیدمیولوژیکی از تست Multiplex PCR در راستای شناسایی پاتوژن‌های ویروسی و باکتریایی استفاده کرده‌اند (موارد اندکی را در جدول زیر مشاهده می‌کنید). این تکنیک برای غربالگری پاتوژن‌های فردی یا مرتبط با علائم، و بررسی ارتباط عفونت با بیماری استفاده شده‌است. علاوه بر این، Multiplex PCR ابزاری قدرتمند و مقرون به‌صرفه برای تعیین تایپ و زیرتایپ سویه‌های پاتوژن در مطالعات اپیدمیولوژیک مختلف می‌باشد.

Multiplex PCR در غربالگری بیماری‌های ژنتیکی

تکثیر و آنالیز چندین ژن یا چندین ناحیه از یک ژنِ مرتبط با بیماری، به‌منظور غربالگری اختلالات ژنتیکی. مثلا شناسایی چند جهش/پلی‌مورفیسم شایع در بیماری فیبروز سیستیک (CF) یا تالاسمی، با هدف قرار دهی چند ناحیه ژنی به‌صورت همزمان

Multiplex PCR در پزشکی قانونی

تکثیر و آنالیز همزمان چندین نشانگر ژنتیکی. مانند آنالیز تکرارهای کوتاه پشت‌سرهم (STRs) برای تعیین هویت، تعیین روابط خانوادگی، یا تولید پروفایل‌های DNA در تحقیقات جنایی

منابع

Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clinical microbiology reviews. 2000 Oct 1;13(4):559-70.

Mahoney JB, Chernesky MA. Multiplex polymerase chain reaction. Molecular methods for viral detection. Academic Press, Inc., New York, NY. 1995 Jan 1:219-37.

Tombuloglu H, Sabit H, Al-Khallaf H, Kabanja JH, Alsaeed M, Al-Saleh N, Al-Suhaimi E. Multiplex real-time RT-PCR method for the diagnosis of SARS-CoV-2 by targeting viral N, RdRP and human RP genes. Scientific Reports. 2022 Feb 18;12(1):2853.

NHS England Genomics Education

سوالات متداول