طراحی پرایمر در تکنیک ARMS-PCR

زمان تخمینی مطالعه: 11 دقیقه

اساس تکنیک ARMS-PCR

تکنیک ARMS-PCR در اواخر دهه 1980 توسط C. R. Newton و همکارانش ابداع شده و اساس آن بر‌مبنای استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای هر الل است.

اما الل (Allele) چیست؟ “الل” کلمه‌ای است که ما برای توصیف شکل یا نسخه‌های مختلف یک ژن استفاده می‌کنیم. انسان‌ها از هر یک از والدین خود، یک الل را برای هر ژن به ارث می‌برند، پس دارای دو نسخه پدری و مادری از هر ژن هستند. به‌طور معمول، ما الل‌ها را در دو دسته طبیعی یا رفرنس، و غیرطبیعی یا جهش‌یافته قرار می‌دهیم. مثلاً ممکن است یک نوکلئوتید از ژن BRCA1 در نسخه پدری ژن شما به‌صورت طبیعی A باشد (الل ref) ولی همان نوکلئوتید در نسخه مادری ژن شما به‌صورت جهش‌یافته C (الل alt) باشد.

در ادامه، سعی کرده‌ایم شما را با نحوه تشخیص این الل‌ها با تکنیک ARMS-PCR آشنا کنیم و اصول طراحی پرایمر برای آن را توضیح دهیم.

مراحل انجام تست ARMS-PCR

برای انجام یک تست معمول ARMS-PCR، باید ۴ مرحله را طی کنید:

طراحی پرایمر >>> اجرای PCR >>> ژل الکتروفورز >>> تفسیر نتایج

طراحی پرایمر برای ARMS-PCR

در روش ARMS-PCR، بایستی ۳ نوع پرایمر طراحی کنید. یک پرایمر اختصاصی برای الل ref، یک پرایمر اختصاصی برای الل alt، و یک پرایمر مشترک.

تصور کنید که می‌خواهید پرایمرهای مستقیمِ (Forward) اختصاصی برای الل موردنظر خود طراحی کنید. به این ‌منظور، بایستی انتهای ‘3 دو پرایمر Forward را به‌گونه‌ای تغییر دهید که یکی از آنها توالی حامل الل ref و دیگری هم الل alt را شناسایی و تکثیر کند. جهت افزایش اختصاصیت پرایمرها و عمل کردن به‌عنوان کنترل، عدم انطباق (mismatch) هم در توالی پرایمر قرار می‌دهیم.

اصلاح پرایمرها مهم‌ترین مرحله در پروتکل ARMS-PCR است.

پیشنهاد: دوره جامع طراحی پرایمر یک فرصت طلایی برای یادگیری حرفه‌ای طراحی پرایمر در تکنیک ARMS-PCR با استفاده از ابزار‌های پرکاربرد در این حوزه است.

ثبت‌نام در دوره جامع طراحی پرایمر

اجرای ARMS-PCR

برای بررسی هر تغییر ژنتیکی، باید از دو میکروتیوب جداگانه برای اجرای PCR استفاده کنید. یکی از میکروتیوب‌ها شامل اجزای PCR با پرایمرهای معکوسِ (Reverse) مشترک و پرایمر Forward برای الل ref، و میکروتیوب‌ دیگر حاوی اجزای PCR با پرایمرهای Reverse مشترک و Forward برای الل alt است. سپس می‌توانید PCR را آغاز کنید.

در طول تکثیر محصولات، پرایمرهایی که در انتهای ‘3 با الگو مطابقت ندارند، قادر به تشکیل جفت‌بازهای مکمل با الگو نیستند، که این امر منجر به عدم تولید محصول می‌شود؛ درحالی‌که پرایمرهایی که با الگو مطابقت دارند، می‌توانند محصولات PCR مربوطه را تکثیر کنند.

ژل الکتروفورز

محصول هر میکروتیوب را بعد از PCR درون چاهک‌های ژل آگارز لود کنید و اجازه دهید که جریان الکتریکی سبب حرکت DNA درون ژل شود.

تفسیر نتایج

بر اساس اینکه کدام میکروتیوب محصول موردنظر ما را تولید کرده و باند قابل شناسایی بر روی ژل ایجاد کرده است، می‌توانیم به ژنوتایپ آن نمونه پی ببریم.

شکل زیر را برای درک ساده‌تر اساس ARMS-PCR طراحی شده‌ است:

مزایا و معایب

مزیت اصلی ARMS-PCR، تشخیص دقیق الل‌های مختلف و تمایز صحیح هموزیگوسیتی و هتروزیگوسیتی است. با این‌حال، این تکنیک محدودیت‌هایی هم دارد که به دو مورد از مهم‌ترین آنها اشاره می‌کنیم:

۱. با این روش فقط می‌توانید Indel‌های کوچک یا SNP‌‌های شناخته‌شده را شناسایی کنید، تغییر یا جهش جدید قابل تشخیص نیست.

۲. این روش شانس نسبتا بالایی برای تولید نتایج مثبت کاذب دارد و به همین دلیل برای انجام این تست به کنترل‌های داخلی، منفی و مثبت نیاز دارید.

انواع ARMS-PCR و کاربردها

تکنیک ARMS-PCR می‌تواند متناسب با هدف محقق، و با تغییر در تعداد پرایمرهای مورد استفاده یا ترکیب با سایر تکنیک‌های وابسته به PCR، بهبود پیدا کند. بنابراین انواع مختلفی از این روش ابداع شده‌اند که در این‌جا به دو مورد از آن‌ها اشاره کرده‌ایم:

پیشنهاد: به‌منظور ثبت سفارش طراحی پرایمر برای ARMS PCR به صفحه تهیه پلن‌های طراحی پرایمر و پروب مراجعه فرمایید.  طراحی پرایمر‌ در میزکار وانیار و زیرنظر کارشناسان بیوانفورماتیک صورت می‌گیرد.

تکنیک Tetra-primer ARMS-PCR

در روش Tetra-primer ARMS-PCR یا آرمز پی سی آر با چهار پرایمر (تترا آرمز پی سی آر)، برای شناسایی یک SNP، چهار پرایمر طراحی می‌شود و همگی در یک میکروتیوب آزمایش ریخته می‌شوند (برخلاف فرم معمولی ARMS-PCR). در این روش مثل تکنیک Nested PCR، یک جفت پرایمر بیرونی داریم که بالادست و پایین‌دست تغییر ژنتیکی موردنظر ما قرار گرفته‌اند (پرایمرهای کنترل مشترک). یک جفت پرایمر درونی هم داریم که هر کدام از آن‌ها برای یک الل (ref و alt) اختصاصی هستند.

اساس تترا آرمز پی سی آر این‌گونه است: همه ژنوتایپ‌ها، محصولی که با پرایمرهای بیرونی تکثیر می‌شود را تولید می‌کنند چراکه این تکثیر وابسته به ژنوتایپ موردنظر ما نیست؛ به بیان دیگر، SNP موردنظر ما در این ناحیه واقع نشده. اما بسته به ژنوتایپ هر فرد، تکثیر با پرایمرهای اختصاصیِ درونی صورت می‌گیرد یا نمی‌گیرد.

باید برای تشخیص ژنوتایپ با این روش، پرایمرهای درونی را طوری طراحی کنید که سایز قطعات حاصل‌شده (محصولات PCR) با هم متفاوت باشند تا طی ژل الکتروفورز بتوانید الل‌های هموزیگوس و هتروزیگوس را تشخیص دهید. هموزیگوت‌ها ۲ باند (یک باند مربوط‌ به کنترل مشترک و یک باند اختصاصی الل) و هتروزیگوت‌ها ۳ باند (یک باند مربوط‌ به کنترل مشترک و دو باند اختصاصی برای هر دو الل) بر روی ژل تشکیل می‌دهند.

این تکنیک تاکنون در بسیاری از مطالعات با هدف ژنوتایپینگ به‌کار رفته‌است. برای مثال، دو مطالعه زیر از روش Tetra-primer ARMS-PCR برای تعیین دقیق ژنوتایپ (هموزیگوسیتی یا هتروزیگوسیتی)  استفاده کرده‌اند:

• تشخیص ارتباط SNP‌های ژن‌های اینترلوکینی مانند IL1β و IL6 با سرطان دهانه رحم
• بررسی SNP‌ها در ژن‌های کد‌کننده پروتئین‌های شیر گاو، مانند کازئین

پیشنهاد: افزایش فرصت‌های شغلی و تحقیقاتی با شرکت در دوره بیوانفورماتیک عمومی و کسب مهارت‌های اساسی بیوانفورماتیک.

ثبت‌نام در دوره بیوانفورماتیک عمومی

تکنیک ARMS qPCR

اگرچه روش اصلی ARMS-PCR نیازی به هضم با آنزیم محدودکننده یا آنالیز توالی DNA محصولات PCR ندارد، اما همچنان به الکتروفورز ژل به‌عنوان ابزاری کیفی برای تعیین ژنوتایپ نیاز دارد.

تکنیک ARMS qPCR یا آرمز پی سی آر کمّی می‌تواند ژنوتایپ را به‌صورت کمّی بررسی کند. در این روش از پروب‌های مخصوص الل یا رنگ فلوئورسنتی مانند سایبرگرین استفاده می‌شود تا در لحظه محصولات اختصاصی تکثیر و شناسایی شوند (Real-time PCR را ببینید).

در این روش هم مانند ARMS-PCR معمولی، از پرایمرهای اختصاصی الل (متفاوت ازنظر نوکلئوتیدهای سر 3’ پرایمر) و دو واکنش برای بررسی هر SNP استفاده می‌شود.

ARMS qPCR از پروتکل Touch Down PCR استفاده می‌کند تا در ابتدا تکثیر با پرایمری که کاملا بر الگو منطبق است انجام شود. همان طور که چرخه PCR پیشرفت می‌کند، دمای اتصالِ (annealing) پایین‌تر، امکان تکثیر با پرایمر غیرمنطبق را هم فراهم می‌کند. این باعث ایجاد یک اختلاف در مقادیر Ct دو واکنش‌ می‌شود که به آن ΔCt می‌گوییم. استفاده از مقدار کمّی ΔCt، یک روش آسان و سریع برای تعیین ژنوتایپ به‌ حساب می‌آید.

کاربرد این تکنیک هم در ژنوتایپینگِ کمّی است. مثال:

• تشخیص و کمّی‌سازی هتروپلاسمی جهش در DNA میتوکندریایی (mtDNA)

نتیجه‌گیری

در این مقاله از مجله بیوانفورماتیک وانیار به معرفی اساس تکنیک ARMS-PCR و کاربرد آن در ژنوتایپینگ پرداختیم. به‌علاوه، به تیپ‌های رایج ARMS-PCR اشاره کردیم، و اصول طراحی پرایمر و نحوه تشخیص زیگوسیتی را با استفاده از این تکنیک توضیح دادیم.

آیا تا‌به‌حال تجربه اجرای ARMS-PCR رو در آزمایشگاه داشتی؟

منابع

Basu C, editor. PCR primer design. New york: Humana Press; 2015 Jan.

Little S. Amplification‐refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics. 1995 Nov;7(1):9-8.

Medrano RF, De Oliveira CA. Guidelines for the tetra-primer ARMS–PCR technique development. Molecular biotechnology. 2014 Jul;56:599-608.

سوالات متداول