تکنیک PCR-RFLP، طراحی پرایمر و انتخاب آنزیم محدود‌کننده

زمان تخمینی مطالعه: 12 دقیقه

اساس تکنیک PCR-RFLP

تکنیک Restriction Fragment Length Polymorphism یا RFLP در سال 1984 توسط دانشمندی انگلیسی به نام Alec Jeffreys در حین تحقیق در‌مورد بیماری‌های ارثی ابداع شد. استفاده از این روش مثل تکنیک ARMS-PCR برای ژنوتایپینگ بسیار رایج است ولی هزینه بیشتری نسبت به آن دارد.

تکنیک RFLP براساس تاثیر آنزیم‌های محدودکننده (restriction enzyme) روی محصول PCR طراحی شده. به این شکل که هر آنزیم، توالی خاصی را روی رشته DNA شناسایی می‌کند و آن را برش می‌دهد تا امکان تعیین ژنوتایپ فراهم شود. از آن‌جا که RFLP بر روی محصول PCR انجام می‌شود، به مجموع این پروسه، PCR-RFLP میگوییم.

پیشنهاد: دوره جامع طراحی پرایمر یک فرصت طلایی برای یادگیری حرفه‌ای طراحی پرایمر با استفاده از ابزار‌های پرکاربرد است.

ثبت‌نام در دور جامع طراحی پرایمر

آنزیم محدود‌کننده

آنزیم محدود کننده که اندونوکلئاز محدود کننده هم نامیده می‌شود، پروتئینی است که باکتری‌ها تولید می‌کنند و با آن DNA را در جایگاه‌های خاصی برش می‌دهند.

آنزیم‌های محدودکننده دو وظیفه اصلی دارند:

۱. محافظت از باکتری‌ها در برابر DNA بیگانه، مانند ویروس‌ها

۲. تسهیل مهندسی ژنتیک با ایجاد امکان برش و چسباندن قطعات DNA

آنزیم‌های محدودکننده توالی‌های خاصی از نوکلئوتیدها را در DNA شناسایی می‌کنند و به آن‌ها متصل می‌شوند. این نواحی، مکان‌های شناسایی (recognition sites) یا مکان‌های محدود (restriction sites) هستند.

مکان‌های شناسایی معمولاً 4 تا 8 جفت‌باز طول دارند و اغلب پالیندرومیک (palindromic) هستند. به این معنا که وقتی در جهت مخالف نیز خوانده می‌شوند، توالی یکسانی در هر دو رشته دارند:

هنگامی که یک آنزیم محدودکننده به محل شناسایی خود متصل می‌شود، پیوندهای فسفودی‌استری بین نوکلئوتیدهای مجاور را می‌شکند و ستون فقرات DNA را قطع می‌کند. بسته به نوع آنزیم محدودکننده، برش می‌تواند انتهای صاف (blunt) یا چسبنده (sticky) در DNA ایجاد کند.

* چهار نوع اصلی آنزیم محدودکننده وجود دارد که بر‌اساس ساختار، ویژگی، محل برش و نیاز‌های کوفاکتور طبقه‌بندی می‌شوند:

آنزیم‌های محدودکننده نوع اول

آنزیم های پیچیده و چند‌زیر‌واحدی هستند. دو جایگاه را شناسایی کرده و DNA را به طور تصادفی و بسیار دورتر از مکان‌های شناسایی خود (با فاصله حدود 1000 جفت‌باز یا بیشتر)، برش می‌دهند. آنزیم‌های محدودکننده نوع اول همچنین دارای قابلیت متیلاسیون DNA هستند تا از DNA میزبان در برابر شکست محافظت کنند.

کوفاکتور: ATP، یون منیزیم، S-آدنوزیل متیونین (SAM)

آنزیم‌های محدودکننده نوع دوم

این آنزیم‌ها ساده‌ترین و پرکاربرد‌ترین آنزیم‌ها برای مهندسی ژنتیک هستند. آنها همودایمرهایی هستند که فقط فعالیت محدود‌کنندگی دارند. آنزیم‌های محدودکننده نوع دوم توالی‌های خاصی را تشخیص می‌دهند که معمولاً پالیندروم و 4 تا 8 جفت باز طول دارند. آنها داخل یا نزدیک مکان‌های شناسایی خود را برش می‌دهند و انتهای صاف یا چسبنده ایجاد می‌کنند.

کوفاکتور: یون منیزیم

آنزیم‌های محدودکننده نوع سوم

این آنزیم‌ها شبیه آنزیم‌های نوع اول هستند که در یک کمپلکس هم فعالیت‌های محدودکنندگی و هم فعالیت‌های اصلاحی دارند. ساختار این آنزیم‌ها به‌صورت هترودایمری است. آن‌ها برای برش موفقیت‌آمیز به دو مکان شناسایی (۵ تا ۶ جفت‌باز) که غیر‌پالیندرومیک هستند نیاز دارند. آنزیم‌های محدودکننده نوع سوم در فاصله ۲۴ تا ۲۶ جفت‌باز دورتر از مکان شناسایی، DNA را برش می‌دهند.

کوفاکتور: ATP، یون منیزیم، S-آدنوزیل متیونین (SAM)

آنزیم‌های محدودکننده نوع چهارم

آنزیم‌های کمیابی هستند که DNA متیل‌دار را در محل نوکلئوتید متیله یا نزدیک به آن برش می‌دهند.

کوفاکتور: ATP و GTP

مراحل تست PCR-RFLP

تکنیک PCR-RFLP شامل چندین مرحله جداگانه است که عبارتند از:

طراحی پرایمر >>> انتخاب آنزیم محدودکننده مناسب >>> اجرای PCR و تایید تکثیر >>> اثردهی آنزیم محدودکننده بر محصول PCR >>> ژل الکتروفورز >>> تفسیر نتایج

طراحی پرایمر

به منظور طراحی یک تست با تکنیک PCR-RFLP، ابتدا باید توالی ژن مورد نظر خود را دریافت یا دانلود کنید. سپس بسته به هدف تحقیق، ناحیه ژنومی مناسبی را که شامل پلی‌مورفیسم‌ها یا واریانت‌های مورد مطالعه‌تان می‌شود، برای طراحی پرایمرهای اختصاصی درنظر بگیرید.

معیار‌های طراحی پرایمر برای تکنیک PCR-RFLP، کاملا مشابه با طراحی پرایمر برای PCR کیفی یا معمولی است. تنها باید دقت کنید که جفت پرایمر‌های فوروارد (Forward) و ریورس (Reverse) در دو طرف ناحیه حامل پلی‌مورفیسم‌ها یا واریانت‌های موردنظرتان قرار بگیرند.

بنابراین برای طراحی پرایمر در تکنیک PCR-RFLP بایستی به فاکتور‌هایی همچون اختصاصیت (Specificity) محصول PCR، دمای ذوب واتصال پرایمرها، انتالپی تشکیل ساختارهای ثانویه برای پرایمر‌ها، و مواردی از این دست توجه کنید. برای آشنایی با معیارهای اساسی طراحی پرایمر، می‌توانید این مقاله را بخوانید.

پیشنهاد: افزایش فرصت‌های شغلی و تحقیقاتی با شرکت در دوره بیوانفورماتیک عمومی و کسب مهارت‌های اساسی بیوانفورماتیک.

ثبت‌نام در دوره بیوانفورماتیک عمومی

انتخاب آنزیم محدودکننده مناسب

در مرحله بعدی با استفاده از ابزارهایی مانند NEBcutter، باید آنزیمی را شناسایی کنید که به‌صورت اختصاصی ناحیه حامل واریانت شما را شناسایی می‌کند. لازم است این آنزیم را طوری انتخاب کنید که محصول PCR را در نقطه قرارگیری واریانت ببرد و قطعاتی با اندازه‌های مختلف بر اساس وجود یا عدم وجود واریانت مورد مطالعه شما تولید کند.

در تصویر زیر، ژنوتایپ بخشی از ژنوم فردی را میبینید که در آن یک SNP برای رشته DNA مادری T و برای رشته پدری C است. با بررسی توالی محصول PCR در NEBcutter، آنزیمی را شناسایی کردیم که می‌تواند واریانت را تشخیص دهد: آنزیم Lmn1

اما چگونه؟؟؟

در‌صورت وجود باز T، جایگاه برش اختصاصی برای Lmn1 ایجاد می‌شود و محصول PCR که بر اساس پرایمرهایی که در این آزمایش طراحی شده‌اند، 421 جفت‌باز طول دارد، به دو قطعه 329 و 92 جفت‌بازی می‌شکند.

اما در‌صورت وجود باز C، برشی در DNA اتفاق نمی‌افتد و محصول PCR با طول کامل 421 جفت‌باز دست‌نخورده می‌ماند.

با استفاده از ژل الکتروفورز و DNA مارکر (DNA ladder) می‌توان وجود الل T یا C را در جایگاه مورد نظر تشخیص داد.

*** نکته مهمی که بایستی در طراحی پرایمر و انتخاب آنزیم محدود‌کننده به آن توجه کنید، دقت به وجود یا عدم وجود سایر جایگاه‌های پلی‌مورفیک در محدوده‌ی پرایمرهای PCR و مکان‌های شناسایی آنزیم است. گاهی ممکن است وجود یک تغییر ژنتیکی در نزدیکی واریانت مورد نظر شما، جایگاه برشی اضافی برای آنزیم ایجاد کند و باعث شود نتایجی غیر‌ قابل پیش‌بینی را بر روی ژل آگارز مشاهده کنید.

اجرای PCR-RFLP و تایید تکثیر

در این مرحله با پرایمر‌های اختصاصی خود PCR را اجرا کنید و برای اطمینان از انجام موفق PCR، سایز محصول را با ژل الکتروفورز بررسی کنید.

اثردهی آنزیم محدودکننده بر محصول PCR-RFLP

در مرحله بعد، باید محصول PCR را با آنزیم محدودکننده‌ای که انتخاب کرده‌اید انکوبه کنید. دقت کنید که هر آنزیم برای نمایش بهترین عملکرد خود، به شرایط دمایی و زمان خاصی نیاز دارد، و بایستی برای گرفتن نتیجه مناسب از تست خود، آن‌‌ها را رعایت کنید.

ژل الکتروفورز

در این مرحله، برای بار دوم محتوای میکروتیوب را با ژل الکتروفورز بررسی می‌کنیم. این‌بار DNA توسط آنزیم محدود‌کننده بریده شده و الگوی خاصی بر روی ژل مشاهده خواهید کرد.

تفسیر نتایج

وجود یا عدم وجود محل تشخیص آنزیم محدودکننده، منجر به ایجاد قطعات DNA با سایزهای مختلف می‌گردد.

پیشنهاد: به‌منظور ثبت سفارش طراحی پرایمر برای PCR-RFLP به صفحه تهیه پلن‌های طراحی پرایمر و پروب مراجعه فرمایید.  طراحی پرایمر‌ در میزکار وانیار و زیرنظر کارشناسان بیوانفورماتیک صورت می‌گیرد.

مزایا و معایب

تعدادی از مزایا و معایب مهم تکنیک PCR-RFLP در جدول زیر آورده شده‌اند:

تکنیک Mismatch PCR-RFLP

علاوه بر رایج‌ترین فرم PCR-RFLP، حالت دیگری از این تکنیک هم کاربرد دارد:

Mismatch PCR-RFLP: در صورت عدم وجود آنزیم اختصاصی برای واریانت موردنظر و یا قرارگیری واریانت در ناحیه خاصی از ژنوم که کار طراحی پرایمر را سخت می‌کند، می‌توان از این تکنیک استفاده کرد. اساس Mismatch PCR-RFLP بر ایجاد یک یا چند عدم تطابق (Mismatch) در انتهای ‘3 پرایمر می‌باشد که یک جایگاه تشخیص مصنوعی برای آنزیم به وجود می‌آورند.

یک مثال ببینیم:

تصویر زیر، روش Mismatch PCR-RFLP را برای تشخیص یک جهش نشان می‌دهد.

در این مطالعه برای شناسایی جهش Transversion (تبدیل T به A که در یک بیضی قرمز قرار دارد) از روشMismatch PCR-RFLP استفاده کردیم. در این‌جا، پرایمر فوروارد (Forward) در باز T که به‌رنگ آبی است، با توالی مرجع متفاوت می‌باشد (Mismatch). دلیل این میس‌مچ این است تا طی PCR و در صورت عدم وجود Transversion (یعنی وجود باز T در جایگاه جهش)، یک جایگاه برش (AGT///ACT) برای آنزیم ScaI ایجاد کند. به این‌صورت که رخ ندادن برش، به‌معنای وجود باز A یا جهش‌یافته در این ناحیه می‌باشد. به‌عنوان کنترل داخلی، یک سایت برش ScaI در پرایمر ریورس (reverse) گنجانده‌ایم.

کاربرد‌ها

تکنیک PCR-RFLP تاکنون در بسیاری از مطالعات تعیین ژنوتایپ، خصوصا SNPهای انسانی به کار رفته است. مثلا محققین برای تعیین SNP‌هایی که استعداد ابتلا به بیماری‌های قلبی-عروقی را بالا می‌برند، از PCR-RFLP برای ژنوتایپینگ جامعه بیمار استفاده می‌کنند.

تکنیک PCR-RFLP علاوه بر اینکه برای تعیین تغییرات ژنتیکی درون گونه‌ای ارزشمند است، برای شناسایی و تمایز گونه‌ها هم بسیار محبوب است. مثل مطالعه‌ای که دانشمندان چینی انجام دادند. آن‌ها بر روی ژن Cytb مربوط به گونه‌های ماهی تن PCR انجام دادند و از پنج آنزیم محدودکننده از جمله Eco147 I، Hinf I، Mbo I، Xag I، و Hind II، برای هضم توالی ژنی Cytb استفاده کردند. دانشمندان چینی به نقشه‌های متفاوت برش DNA برای هرگونه دست یافتند که به افتراق گونه‌ها کمک کرد.

نتیجه‌گیری

در این مقاله از مجله بیوانفورماتیک وانیار به معرفی اساس تکنیک PCR-RFLP و کاربرد آن در ژنوتایپینگ پرداختیم. درمورد آنزیم‌های محدود‌کننده و انواع آنها مطالبی گفتیم. سپس به بحث طراحی پرایمر و انتخاب آنزیم محدودکننده مناسب برای PCR-RFLP اشاره کردیم. بنابراین در این مقاله سعی کردیم شما را با نحوه ژنوتایپینگ توسط تکنیک PCR-RFLP آشنا کنیم.

آیا تجربه‌ استفاده از تکنیک PCR-RFLP رو داری؟

منابع

Rasmussen HB. Restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified fragments (PCR-RFLP) and gel electrophoresis-valuable tool for genotyping and genetic fingerprinting. InGel electrophoresis-principles and basics 2012 Apr 4. InTechopen

Yao L, Lu J, Qu M, Jiang Y, Li F, Guo Y, Wang L, Zhai Y. Methodology and application of PCR‐RFLP for species identification in tuna sashimi. Food Science & Nutrition. 2020 Jul;8(7):3138-46

سوالات متداول